“菲”常有道 | 菲鵬生物免疫診斷試劑原料開(kāi)發(fā)經(jīng)驗(yàn)分享
7月20日，由全國(guó)體外診斷網(wǎng)（CAIVD）主辦的《破勢(shì)?免疫診斷試劑抗原抗體自研自產(chǎn)研討會(huì)》云會(huì)議取得全滿(mǎn)成功，菲鵬生物項(xiàng)目研發(fā)總監(jiān)郭亮博士受邀參加了本次研討會(huì)，并從不同檢測(cè)方法學(xué)對(duì)核心原料的選擇、抗原開(kāi)發(fā)的核心問(wèn)題及優(yōu)化技巧、抗體開(kāi)發(fā)過(guò)程中面臨的問(wèn)題及穩(wěn)定性?xún)?yōu)化策略等內(nèi)容分享了菲鵬生物對(duì)于免疫診斷試劑原料開(kāi)發(fā)的認(rèn)識(shí)和經(jīng)驗(yàn)。
PART 01
不同檢測(cè)方法學(xué)對(duì)核心原料的選擇
目前常用的免疫檢測(cè)方法包括四種：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）、層析免疫分析（LFIA）、乳膠增強(qiáng)比濁免疫分析（LETIA），不同的檢測(cè)方法都遵循免疫反應(yīng)的底層原理，即抗原抗體親和反應(yīng)，不同檢測(cè)方法學(xué)對(duì)抗原抗體的應(yīng)用方法不同，所以對(duì)抗原抗體的要求也不同。
如ELISA對(duì)于被固定或帶檢測(cè)標(biāo)記物的抗原或抗體有很高的生物活性和純度要求，抗體多采用單抗，一些廠(chǎng)商為提高抗體特異性，會(huì)采用酶切后的抗體片段如不包含F(xiàn)c的F(ab')2片段。
CLIA既可采用單克隆抗體，也可采用多克隆抗體。但需要注意的是，由于我們通常使用的是兔抗或鼠抗原料，對(duì)某些臨床樣本會(huì)產(chǎn)生非特異性反應(yīng)。因?yàn)闃颖局锌赡艽嬖卺槍?duì)動(dòng)物免疫球蛋白的抗體，所以會(huì)在雙單克隆夾心法模式中產(chǎn)生假陽(yáng)性現(xiàn)象。
PART 02
抗原開(kāi)發(fā)的核心問(wèn)題和優(yōu)化技巧
在抗原開(kāi)發(fā)過(guò)程中，蛋白質(zhì)樣品的純度水平?jīng)Q定其對(duì)下游測(cè)試的影響，因此蛋白純度一般是原料廠(chǎng)商最關(guān)心的核心問(wèn)題。而蛋白表達(dá)純化的得率、檢測(cè)中的活性和原料的穩(wěn)定性都與蛋白純度有著密切關(guān)系，因此對(duì)蛋白純化工藝的優(yōu)化可從以上三方面進(jìn)行考慮。
包涵體的純化和復(fù)性折疊策略
包涵體是蛋白表達(dá)過(guò)程中經(jīng)常遇到的現(xiàn)象，如果我們無(wú)法通過(guò)優(yōu)化蛋白表達(dá)來(lái)解決包涵體問(wèn)題，只能通過(guò)摸索不同復(fù)性工藝，使蛋白重新折疊形成類(lèi)似天然的二級(jí)結(jié)構(gòu)。菲鵬生物在此分享幾點(diǎn)在蛋白純化過(guò)程中形成包涵體和對(duì)其復(fù)性折疊的策略：
首先我們可通過(guò)同源蛋白數(shù)據(jù)模擬分析或其他已有的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)來(lái)了解目的蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，之后根據(jù)二級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)選擇適合的復(fù)性溶解試劑，同時(shí)也要考慮溶解劑的去除對(duì)下游工藝或作為免疫原的影響，有時(shí)還需要將不同溶解劑串聯(lián)使用，例如：使用提高pH促溶掛柱，洗脫后立即用帶有DMSO的緩沖液中和pH，從而穩(wěn)定復(fù)性后的正確折疊。
圖源：Singh, A., Upadhyay, V., Upadhyay, A.K. et al. Protein recovery from inclusion bodies of Escherichia coli using mild solubilization process. Microb Cell Fact 14, 41 (2015).
常用表面活性劑使用策略
在提取過(guò)程中使用表面活性劑也是提高抗原或抗體活性和穩(wěn)定性的一種方法。菲鵬生物總結(jié)了不同表面活性劑的物理性質(zhì)（如下圖），在使用過(guò)程中需要從溫度、類(lèi)型、使用濃度、溶解目標(biāo)和下游檢測(cè)影響等進(jìn)行綜合考慮。例如：SDS是一種強(qiáng)陰離子表面活性劑，容易破壞蛋白，且難以去除，使用時(shí)需謹(jǐn)慎；Digitonin可溶解真核細(xì)胞膜，但不能溶解原核細(xì)胞膜；Triton X-100可溶解細(xì)菌內(nèi)膜但不能溶解細(xì)菌外膜，此外，Triton X-100還能夠吸收紫外線(xiàn)，對(duì)下游檢測(cè)會(huì)有影響等。
PART 03
抗體開(kāi)發(fā)過(guò)程中面臨的問(wèn)題及穩(wěn)定性?xún)?yōu)化策略
原料廠(chǎng)商在抗體開(kāi)發(fā)過(guò)程中經(jīng)常會(huì)遇到免疫動(dòng)物效價(jià)低、抗體陽(yáng)性率高但親和力不夠以及抗體穩(wěn)定性差等問(wèn)題。雖然我們可以通過(guò)不同抗體發(fā)現(xiàn)路徑找到活性高的抗體，但作為試劑開(kāi)發(fā)的原料，抗體的穩(wěn)定性起決定性作用。
抗體的穩(wěn)定性品控可從濃度、純度、活性和外觀(guān)來(lái)考量。關(guān)于如何提高抗體的穩(wěn)定性，菲鵬生物建議從抗體工程和生產(chǎn)工藝優(yōu)化兩個(gè)方向進(jìn)行優(yōu)化。
此外，抗體穩(wěn)定性評(píng)估還需要借助多種檢測(cè)手段來(lái)綜合分析。菲鵬生物總結(jié)了八種常用的抗體檢測(cè)技術(shù)，如通過(guò)表面等離子體共振技術(shù)（SPR）分析發(fā)現(xiàn)，抗體的親和力能夠決定試劑檢測(cè)的靈敏度；動(dòng)態(tài)光散射（DLS）可用于考察抗體的穩(wěn)定性；抗體純度可通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、體積排阻色譜（SEC-HPLC）、十二烷基硫酸鈉毛細(xì)管電泳（CE-SDS）三種方式進(jìn)行確認(rèn)；毛細(xì)管等電聚焦電泳（CIEF)是檢測(cè)分析抗體電荷異構(gòu)體的有效手段。
常見(jiàn)問(wèn)題解答
抗原表達(dá)的構(gòu)建設(shè)計(jì)有哪些優(yōu)先考慮的建議？
抗原開(kāi)發(fā)首先要熟悉目的蛋白信息，包括結(jié)構(gòu)、功能和生理基質(zhì)等，這些信息在構(gòu)建設(shè)計(jì)時(shí)都可以利用或回避。另外，表達(dá)單一結(jié)構(gòu)域還是全長(zhǎng)、載體的選擇和表達(dá)宿主的選擇都是可以?xún)?yōu)先考慮的。例如，基于病原體靶蛋白的研究來(lái)選擇結(jié)構(gòu)域，或考慮表位篩選及選擇嵌合表位來(lái)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)；選擇合適融合蛋白也是常用的手段；如果表達(dá)的抗原在檢測(cè)中出現(xiàn)假陽(yáng)性或不穩(wěn)定問(wèn)題時(shí)，我們可通過(guò)突變修飾進(jìn)行改善等等。
試劑抗體也需要做人源化和Fc改造嗎？
試劑抗體人源化不是必須的，人源化抗體理論上可以避免人抗鼠抗體（HAMA）效應(yīng)的產(chǎn)生，具體來(lái)講，將小鼠抗體進(jìn)行人源化改造后，只有被改造抗體的CDR區(qū)是小鼠來(lái)源，抗體其他區(qū)域都是人源的。人源化抗體改造的目標(biāo)是CDR移植，改造后的效果需要做大量實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。同樣Fc的改造也不是必須的，這種抗體分子改造方法目的是實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定性和功能性的改善。Fc改造是對(duì)抗體恒定區(qū)進(jìn)行改造，是否需要Fc改造還要結(jié)合項(xiàng)目的具體應(yīng)用場(chǎng)景來(lái)考慮。
菲鵬生物目前可提供完整的原料解決方案服務(wù)，如果您有免疫診斷試劑原料開(kāi)發(fā)的需求，歡迎通過(guò)以下方式與菲鵬生物取得聯(lián)系！
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